سوالات متداول - ۵

شاخص های موثر بر کیفیت توالی یابی سانگر چه هستند؟

  • در توالی یابی محصول PCR و یا پلاسمید نوترکیب آنچه که بسیار اهمیت دارد رعایت تناسب بین طول باند و غلظت باند تخلیص شده محصول PCR و یا پلاسمید می باشد. لطفا توجه بفرمایید که غلظت بسیار زیاد محصول PCR الزاما مطلوب نیست.

لطفا به شکل زیر توجه فرمایید.

ژل الکتروفورز آگارز (تهیه شده توسط تیم متخصص توپاز ژن کاوش) تناسب غلظت محصول PCR با طول توالی مورد نظر برای توالی یابی را نشان میدهد. در صورت عدم امکان سنجش دقیق غلظت محصول PCR ، غلظت محصول PCR خود را با عکس فوق مطابقت داده و سپس جهت توالی یابی اقدام نمایید.

  • روش تخلیص پلاسمید و یا محصول PCR نیز در کیفیت نتایج بسیار موثر می باشد. در این زمینه استفاده از کیتهای ستونی تخلیص قویا پیشنهاد می شود. استخراج از ژل اغلب در توالی یابی نتیجه مطلوبی ندارد.
  • 40 -50 نوکلئوتید اولیه در توالی یابی  سانگر اغلب نتیجه مناسبی ندارد. این ناحیه محل اتصال پرایمر می باشد. در صورتی که  توالی دقیق این ناحیه مورد نیاز است کلونینگ محصول PCR  و توالی یابی وکتور قویا پیشنهاد میشود.
  • طول خوانش در هر بار خوانش فوروارد و ریورس درتوالی یابی سانگر در بهترین حالت 800 نوکلئوتید می باشد.  در صورتی که آمپلیکون مورد نظر طول بیش از 800 جفت باز دارد برای دستیابی به طول کامل قطعه از دو خوانش فوروارد و ریورس استفاده نمایید.